WO2001066121A1 - OLEORRESINA DE HYPERICUM PERFORATUM L., PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y_Usos - Google Patents

OLEORRESINA DE HYPERICUM PERFORATUM L., PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y_Usos Download PDF

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WO2001066121A1
WO2001066121A1 PCT/ES2001/000080 ES0100080W WO0166121A1 WO 2001066121 A1 WO2001066121 A1 WO 2001066121A1 ES 0100080 W ES0100080 W ES 0100080W WO 0166121 A1 WO0166121 A1 WO 0166121A1
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hypeπcum
water
perforatum
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Inventor
Eliseo Quintanilla Almagro
Ana Ramirez Bosca
August Abernd
Jose Pardo Zapata
Joaquín DIAZ ALPERI
David Pamies Mira
Miguel Angel CARRION GUTIÉRREZ
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Asac Compañia De Biotecnologia E Investigacion, S.A.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention describes an oleoresin or pedic extract of Hype ⁇ cum perforatum L which contains hype ⁇ cina and enriched in hyperfonnas stable over time without the addition of stabilizers.
  • the extract is obtained by extraction with solvents of low polarity and subsequent purification by reextraction with water-alkanols.
  • the invention also relates to water-soluble gels whose active ingredient is Hypencum perforatum L oleoresin for use as a healing agent.
  • Hype ⁇ cum perforatum L as a healing agent and in the treatment of burns has long been known for folk medicine.
  • Hype ⁇ cum perforatum L hyperfo ⁇ nas and adhiperfo ⁇ nas acylfloroglucinoles stand out, also in the Hype ⁇ cum perforatum are the naptidiantrones hype ⁇ cma and pseudohipe ⁇ cina These compounds are responsible for the activity of the extracts in the treatment of wounds and scars, but these products are unstable when you try to obtain them in their pure state and decompose over time, by the action of light and heat
  • European patent EP0854726 describes the obtaining of stabilized extracts of Hype ⁇ cum perforatum L by the addition of antioxidant preservatives such as ascorbic acid, cysteine and / or glutathione, the plant being extracted by organic solvents or alcohol-water mixtures.
  • the galenic formulations described in the state of the art DE2406452 are ointments containing as active ingredients the fresh Hypericum leaves and as diluting fatty type excipients (olive oil, beeswax, fatty acid esters, etc.) , providing an ointment of lipophilic nature and insoluble in water.
  • the extracts of Hypericum perforatum L. have shown different pharmacological activities, mainly as healing agents as mentioned above, but to date the activity of the extracts on the modulation of the extracellular matrix (ECM) of fibroblasts has not been described.
  • ECM extracellular matrix
  • the technical problem of the invention is to provide stabilized extracts of Hypericum perforatum L, without the addition of stable preservatives over time without losing their active components and that retain their pharmacological activity.
  • the invention is surprisingly based on the stability of Hypericum perforatum L lipid extracts, which contain all their natural components: hyperforins and hyperkines, in a lipid-like matrix, these extracts being stable over time. time without the addition of preservatives Lipid extracts or oleorescence are obtained by extraction with solvents of low polarity capable of extracting the lipid components of the drug and subsequent purification by reextraction with water-alkanols
  • the extracts have a content greater than 10% in hyperfo ⁇ nas and a content in hype ⁇ cinas greater than 0.5% in a lipid matrix that stabilizes the active ingredients of Hype ⁇ cum perforatum L
  • the extracts have shown a dose-dependent activity in the regulation of the production of the components of the extracellular matrix In this way the possible toxicity of the product is avoided since the production of collagen and tenastma is inhibited at high doses and on the other hand prevents the formation of hypertrophic scars and keloids
  • the extracts described can be used in pharmaceutical or galenic preparations such as water-soluble gels as healing agents that improve bioavailability, which prevent maceration in skin, which improve the application of the product against the formulations described by the state of the art based on excipients fatty or pophilic Likewise with the use of water-soluble gels, a better follow-up of the lesions can be carried out because it is a transparent gel
  • the invention is based on the stability of the Hype ⁇ cum perforatum L extracts, characterized by the presence of hype ⁇ cma and hyperfo ⁇ nas in a matrix of lipid nature
  • the extracts are obtained by extracting Hype ⁇ cum perforatum L first with a solvent of low polarity and subsequent reextraction with hot-water-alcohol mixtures, obtaining a fluid oleorescence with a hyperfo ⁇ na content greater than 10% and a hype ⁇ cine content greater than 0.5% Hype ⁇ cum perforatum L fluid oleoresins obtained by extractions with low polarity solvents and subsequent reextraction with low weight alkanol mixtures Molecular and hot water, they have been stable, without losing their hyperphobic content under the action of light and temperature.
  • the hyperphobic content after a year of storage at 40 ° C exposed to light and at room temperature has shown a content in hyperio ⁇ nas of 15%
  • the Hype ⁇ cum perforatum L is extracted at low temperature with solvents with a polarity of less than 0.6, the solvent to be used is not critical, and solvent mixtures can be used
  • the plant is extracted in the proportion of one part of a drug for every 6 parts of solvent, by 24 hour maceration at a temperature less than or equal to 20 ° C, then it is filtered and the drug is re-extracted by maceration for 24 hours, so on until the extraction is depleted
  • the extracts in liquid form are concentrated until obtaining a soft and fluid syrup by means of high vacuum and at a temperature below 40 ° C
  • the soft liquid syrup is purified by dissolving in a mixture of alkanols-water and filtered, preferably using low molecular weight alcohols such as methanol, ethanol or isopropanol.
  • the solution is made at 40-50 ° C and once filtered concentrated under reduced pressure to obtain a fluid oleoresin
  • the oleoresins obtained have a high content in hyperfo ⁇ nas of 10-15% and a content in hype ⁇ cmas stable over time, determined by chromatographic or spectrophotomatic techniques.
  • Additional steps can be added to the extraction process, such as selecting the starting raw materials with a hyperfo ⁇ na content greater than 2%, dehydration of the material materials at a temperature below 35 ° C, plant cogenization, etc.
  • water-soluble gels are obtained that facilitate the release of oleoresin from Hype ⁇ cum perforatum L, of a fat-soluble nature, allowing diffusion between the structures of the corneal layer obtaining a greater bioavailability than in oil solutions
  • These water-soluble gels contain diluents, emulsifying gelling moisturizers and preservatives
  • the preservatives are dissolved in water and the Hype ⁇ cum perforatum L oleoresin is dissolved in the emulsifiers. On this mixture the preservatives dissolved in water are incorporated, subsequently incorporating the humectants and gelling agents slowly and slowly preventing occlusion of air
  • water can be used as a diluent, g ce ⁇ na as g ce ⁇ lo palmitate humectant as a gelling agent, parabens as preservatives and PEG-40-hydrogenant Castor Oil Polorsorbate-20 and Octoxynol-1 1 as emulsifiers
  • Hype ⁇ cum oleoresins regulate the production of extracellular matrix (ECM) components such as collagen and tenastma, but surprisingly this regulation is dose dependent
  • Hype ⁇ cum perforatum L oleoresins at low concentrations increase production by 70% collagen synthesis in fibroblast cultures but at concentrations greater than 5 ⁇ g / ml collagen synthesis is inhibited, avoiding possible product toxicity and avoiding the formation of hypertrophic or keloid scars 5
  • the production of tenascin decreases after the treatment of the fibroblasts with the Hype ⁇ cum oleoresin for 24 h at 37 ° C in a dose-dependent manner
  • Example 1 Illustrates the procedure for obtaining the oleoresins of Hypericum perforatum L.
  • Example 2 Illustrates the stability of the extracts.
  • the extracts A, B, C are oleoresres of Hype ⁇ cum perforatum L obtained according to the invention and extract D, an extract of Hype ⁇ cum perforatum L obtained by extraction with ethanol, water (50 50)
  • the oleoresins of Hype ⁇ cum perforatum L obtained according to the invention are stable and the hyperfo ⁇ nas content does not decrease with temperature or light
  • Example 3 Illustrates the regulation of the production of extracellular membrane components.
  • the fibroblasts were obtained from the surgical material. Skin samples were pre-incubated for 2 hours at 40 ° C in RPMI 1640 with 2% penicillin / espreptomycin. Fatty tissues were removed and the skin was cut into small pieces and fixed. in culture discs moistened with calf serum (FCS) The skin pieces were incubated at 37 ° C in a CO2 atmosphere in RPMI with 10% FCS and 1% penicillin / streptonicin The culture medium was changed 2 times per week The fibroblast culture was t ⁇ psinized (t ⁇ psin / EDTA 0.0% / 0.02%) and subcultured. Cells from 4th to 14th were used.
  • FCS calf serum
  • the contents of the plates were transferred to polypropylene tubes in which 800 ⁇ l of 0.5M acetic acid was added which contained a soluble neutral salt of rat skin collagen (200 ⁇ l) as a diluent
  • the tubes were centrifuged at 4000 g for 20 minutes
  • the collagen was precipitated from the supernatant by the addition of 250 ⁇ l of NaCI in acetic acid (25%) pro tube
  • the tubes were centrifuged at 4,000 g for 30 minutes the precipitates were redissolved in 0.15M 0.15M NaCl in 0.05M of t ⁇ s-HCI, pH 7.5
  • the collagen was precipitated by the addition of 2 ml of 4.5M NaCl in the same buffer
  • the tubes were centrifuged at 4000 g for 30 minutes
  • the supernatant was discarded and the collagen precipitates were washed in 2 ml of 2% ethanol and centrifuged at 4000 g for 30 minutes
  • each precipitate was dissolved in 250 ⁇
  • the fibroblasts were cultured in microplates with a density of 20,000 cells per plate with RPMI medium without FCS After 24 hours at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere the culture medium was changed. The cells were incubated 48 hours more at 37 ° C with different concentrations of oleoresin The cells were washed 3 times with PBS with 1% BSA and 0.1% Tween 20 The cells were fixed with a methanol / acetone solution (1 1) and washed 3 times as described above and incubated with a monoclone antitenascin antibody! for 1 hour at 37 ° C. After washing, the cells were incubated with a goat anti-mouse monoclonal antibody with alkaline phosphatase.
  • the cells were washed 3 times and incubated with p-nitrophenyl phosphate (1 mg / ml) for 15 minutes.
  • the microplates were centrifuged at 200 g and 100 ⁇ l of the supernatant transferred to a new microplate.
  • the plates were read in an ELISA reader at 405 nm.
  • Example 4 Illustrates the results obtained with the water-soluble oleoresin gel of Hypericum perforatum L. in the healing agent.
  • Product B - Water-soluble gel with a 0.5% oleoresin content of Hypericum perforatum L.
  • Group 2 Patients with dermatological pathology that requires surgical excision and closure by suture, the wounds are treated clinically

Abstract

Se describe una Oleorresina de Hypericum perforatum L. estable con el tiempo en el contenido de Hyperforinas e Hypericinas sin adición de conservantes; un procedimiento de obtención de la Oleorresina mediante extracción con disolventes de baja polaridady posterior purificación; así mismo, se dsescribe su uso como regulator de los componentes de la matriz extracelular y uso para la fabricación de geles hidrosolubles que contienen Oleorresina de Hypericum perforatum L..

Description

//TITULO DE LA INVENCIÓN
Oleorresma de Hxpenc m peí foi atum L Procedimiento de Obtención v Usos
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una oleorresina o extracto pidico de Hypeπcum perforatum L que contiene hipeπcina y enriquecido en hiperfonnas estable con el tiempo sin adición de estabilizantes El extracto es obtenido por extracción con disolventes de baja polaridad y posterior purificación por reextraccion con alcanoles-agua La invención describe el uso de la oleorresina como regulador de los componentes de la matriz extracelular de forma dosis- dependiente
La invención se refiere ademas a geles hidrosolubles cuyo principio activo es la oleorresina de Hypencum perforatum L para su uso como cicatrizante
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El uso del Hypeπcum perforatum L como cicatrizante y en el tratamiento de las quemaduras es conocido desde hace tiempo por la medicina popular
Entre las especies químicas presentes en el Hypeπcum perforatum L , destacan los acilfloroglucinoles hiperfoπnas y adhiperfoπnas, también en el Hypeπcum perforatum se encuentran las naptodiantronas hipeπcma y pseudohipeπcina Estos compuestos son los responsables de la actividad de los extractos en el tratamiento de las heridas y de las cicatrices, pero estos productos son inestables cuando se intenta obtenerlos en estado puro y descomponen con el tiempo , por la acción de la luz y del calor
La patente europea EP0854726 describe la obtención de extractos estabilizados de Hypeπcum perforatum L mediante la adición de conservantes antioxidantes tales como acido ascorbico, cisteína y/o glutationa, extrayéndose la planta mediante disolventes orgánicos o mezclas de alcohol-agua.
Por otra parte las formulaciones galénicas descritas en el estado de la técnica DE2406452 son ungüentos que contienen como principios activos las hojas frescas de Hypericum y como excipientes diluyentes de tipo graso (aceite de oliva, ceras de abeja, esteres de ácidos grasos, etc.), proporcionando un ungüento de naturaleza lipofílica e insoluble en agua.
Sin embargo estas formulaciones de tipo graso producen una maceración en la piel tras su uso prolongado, y poseen una biodisponibilidad reducida que dificulta el lavado de las lesiones, y no se observa adecuadamente el seguimiento de las lesiones.
Los extractos de Hypericum perforatum L. han mostrado diferentes actividades farmacológicas, principalmente como cicatrizantes como se ha comentado anteriormente, pero hasta la fecha no se ha descrito la actividad de los extractos sobre la modulación de la matriz extracelular (ECM) de los fibroblastos. Asi los componentes de los colágenos son los responsables de las propiedades mecánicas de la piel mientras que la tenascina es la responsable de la regulación de las moléculas de adhesión y la migración en los procesos de cicatrización.
El problema técnico de la invención es proporcionar extractos estabilizados de Hypericum perforatum L, sin la adición de conservantes estables con el tiempo sin perder sus componentes activos y que conserven su actividad farmacológica. Además su uso en una composición farmacéutica hidrosoluble y estable que contenga el extracto de Hypericum perforatum L. enriquecido en hiperforinas para evitar la maceración de la piel que se produce con el tratamiento de ungüentos y cremas lipofílicas, que mejore la biodisponibilidad y que se observe mejor la evaluación de las lesiones.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La invención se basa sorprendentemente en la estabilidad de los extractos lipidíeos de Hypericum perforatum L, que contienen todos sus componentes naturales: hiperforinas e hipercinas, en una matriz de tipo lipídico, siendo estos extractos estables con el tiempo con el tiempo sin la adición de conservantes Los extractos lipidíeos o oleorresmas se obtienen mediante extracción con disolventes de baja polaridad capaces de extraer los componentes lipidíeos de la droga y posterior purificación por reextracción con alcanoles-agua
Los extractos tienen un contenido superior al 10% en hiperfoπnas y una contenido en hipeπcinas superior al 0,5% en una matriz lipidica que estabiliza los principios activos del Hypeπcum perforatum L
Los extractos han mostrado una actividad dosis-dependiente en la regulación de la producción de los componentes de la matriz extracelular De esta forma se evita la posible toxicidad del producto ya que se inhibe la producción de colágeno y tenastma a dosis elevadas y por otra parte se evita la formación de cicatrices hipertróficas y queloides
Los extractos descritos pueden ser utilizados en preparaciones farmacéuticas o galénicas como geles hidrosolubles como agentes cicatrizantes que mejoran la biodisponibilidad, que evitan la maceración en piel, que mejoran la aplicación del producto frente a las formulaciones descritas por el estado de la técnica a base de excipientes grasos o pofílicos Así mismo con el uso de geles hidrosolubles se puede llevar un mejor seguimiento de las lesiones por ser un gel transparente
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención está basada en la estabilidad de los extractos de Hypeπcum perforatum L , caracterizados por la presencia de hipeπcma e hiperfoπnas en una matriz de naturaleza lipídica
Los extractos son obtenidos mediante la extracción de Hypeπcum perforatum L primeramente con un disolvente de baja polaridad y posterior reextracción con mezclas de alcohol-agua en caliente, obteniéndose una oleorresma fluida con un contenido en hiperfoπnas superior al 10% y un contenido en hipeπcinas superior al 0,5% Las oleorresinas fluidas de Hypeπcum perforatum L obtenidas mediante extracciones con disolventes de baja polaridad y posterior reextraccion con mezclas alcanoles de bajo peso molecular y agua en caliente, se han mostrado estables, sin perder su contenido en hiperfoπnas bajo la acción de la luz y temperatura El contenido en hiperfoπnas tras un año de almacenamiento a 40°C expuestas a la luz y a temperatura ambiente han mostrado un contenido en hiperíoπnas del 15%
En una forma de realización preferida de la invención para la realización del extracto se extrae el Hypeπcum perforatum L a baja temperatura con disolventes con una polaridad menor a 0,6, no siendo critico el disolvente a emplear, pudiéndose emplear mezclas de disolventes
La planta se extrae en la proporción de una parte de droga por cada 6 partes de solvente, mediante maceracion de 24 horas a una temperatura menor o igual a 20°C, a continuación se procede a su filtración y se vuelve a extraer la droga mediante maceración durante 24 horas, así sucesivamente hasta agotar la extracción
Los extractos en forma liquida son concentrados hasta obtener un jarabe blando y fluido mediante alto vacio y a una temperatura inferior a 40°C
El jarabe blando fluido se purifica por disolución en una mezcla de alcanoles-agua y se filtra, siendo preferiblemente el uso de alcoholes de bajo peso molecular como metanol, etanol o isopropanol La solución se realiza a 40-50°C y una vez filtrada se concentra a presión reducida obteniéndose una oleorresina fluida
Mediante este procedimiento de extracción las oleorresinas obtenidas tienen un alto contenido en hiperfoπnas del 10-15% y un contenido en hipeπcmas del 0,5% estables con el tiempo, determinados por técnicas cromatográficas o espectrofotométπcas Con el fin de optimizar el procedimiento de extracción se pueden añadir pasos adicionales el proceso de extracción tales como seleccionar las materias primas de partida de un contenido en hiperfoπna superior al 2%, deshidratación de los materiales de materia una temperatura inferior a 35°C, cπogenización de la planta, etc
Por otra parte, según la invención se obtienen geles hidrosolubles que faciliten la liberación de la oleorresina de Hypeπcum perforatum L , de naturaleza liposolubles, permitiendo la difusión entre las estructuras de la capa cornea obteniéndose una biodisponibilidad mayor que en las soluciones oleosas Estos geles hidrosolubles contienen diluyentes, humectantes gelificantes emulsificantes y conservantes
En un modo de realización de la invención los conservantes se disuelven en agua y la oleorresina de Hypeπcum perforatum L se disuelve en los emulsificantes Sobre esta mezcla se incorporan los conservantes disueltos en agua incorporando posteriormente y lentamente los humectantes y los agentes gelificante evitando la oclusión de aire
Preferentemente se puede utilizar agua como diluyente, g ceπna como humectante palmitato de g ceπlo como gelificante, parabenos como conservantes y PEG-40-hydrogenante Castor Oil Polιsorbato-20 y Octoxιnol-1 1 como emulsificantes
Siendo las proporciones preferidas para la invención las siguientes
Oleorresma de Hypeπcum 0 1-0,5 %
Agua 60 - 80%
G ceπna y Po acπlato de gliceπlo 20 - 30%
PEG-40-Hydrogenated castor oil
Polιsorbato-20 y Octoxιnol-1 1 1 - 3%
Parabenos 0,2 - 0,4%
Las oleorresinas de Hypeπcum regulan la producción de los componentes de la matriz extracelular (ECM) tales como colágeno y tenastma, pero sorprendentemente esta regulación es dosis dependiente
Las oleorresinas de Hypeπcum perforatum L a bajas concentraciones (0,5-1 μg/ml) aumentan la producción un 70% síntesis de colágenos en cultivos de fibroblastos pero a concentraciones mayores de 5μg/ml se inhibe la síntesis de colágenos, evitando la posible toxicidad del producto y evitando la formación de cicatrices hipertróficas o queloideas 5 Según los resultados obtenidos en la invención la producción de tenascina decrece después del tratamiento de los fibroblastos con la oleorresina de Hypeπcum durante 24 h a 37°C de una forma dosis dependiente
A continuación se describe la invención mediante los ejemplos característicos, no siendo i o limitativos estos del alcance de la invención
Ejemplo 1. Ilustra el procedimiento de obtención de las oleorresinas de Hypericum perforatum L.
100 kilos de flores y hojas deshidratadas de Hypeπcum perforatum L , a menos de 35° C y con un contenido en hiperfoπnas superior al 2% son maceradas con 600 litros de cloruro de metileno acetona (50 50) durante 24 horas a 20°C Este proceso se repite 3 veces más hasta que la extracción este completada Los extractos líquidos se concentran a vacío y a una temperatura inferior a 40°C hasta obtener 8 Kg de jarabe blando fluido El extracto anterior se
20 solubi za en una mezcla de 100 litros etanol agua (60 40) a 50°C mediante agitación durante 2 horas y se purifica mediante filtración por membrana de 5 mieras El filtrado de concentración reducida y se obtiene una oleorresina fluida en caliente que queda en forma de pasta al enfriarse Se obtienen 7,5 Kg de oleorresma de Hypeπcum perforatum L con un contenido en hiperfoπnas del 14% e hipeπcinas del 0,6%
25
Ejemplo 2. Ilustra la estabilidad de los extractos.
1 - Estabilidad a temperatura ambiente
30 T= 0
Figure imgf000007_0001
T=12 meses a 25°C
Figure imgf000008_0001
Siendo los extractos A, B, C oleorresmas de Hypeπcum perforatum L obtenidas según la invención y el extracto D, un extracto de Hypeπcum perforatum L obtenido por extracción con etanol, agua (50 50)
El contenido en hyperofina se ha determinado por HPLC
2 - Estabilidad a 40°C T=0
Figure imgf000008_0002
3 - Estabilidad a luz T=0
Hyperfoπna Adhyperfoπna Hyperfoπnas
Totales
7,7% 7,3% 15% T=12 Sometido a luz natural
Figure imgf000009_0001
4 - Conclusión
Loas oleorresinas de Hypeπcum perforatum L obtenidas según la invención son estables y el contenido en hyperfoπnas no disminuyen ni con la temperatura ni con la luz
Ejemplo 3.- Ilustra la regulación de la producción de los componentes de la membrana extracelular.
Cultivos celulares.
Los fibroblastos se obtuvieron a partir del material quirúrgico Las muestras de piel se pre- incubaron durante 2 horas a 40°C en RPMI 1640 con un 2% de penicilina/espreptomicina Los tejidos grasos se eliminaron y la piel se corto en pequeños trozos y fijados en discos de cultivos humecidos con suero de feto de ternero (FCS) Los trozos de piel se incubaron a 37°C en atmosfera de CO2 en RPMI con un 10% de FCS y un 1 % de penicilina/estreptonicina El medio de cultivo se cambio por 2 veces por semana El cultivo de fibroblastos se tπpsinizó (tπpsin/EDTA 0,0%/0,02%) y se procedió al subcultivo Se utilizaron las células procedentes del 4° al 14°
Síntesis de colágeno. Los fibroblastos humanos se cultivaron en microplacas para tejidos celulares, cada placa se inoculó con 10 000 células en 100μl de medio RMPI suplementado con FCS (10%) y ácido ascórbico (50μl/ml) Después de 24 horas de incubación en una atmósfera humificada de CO2 al 5% el medio de cultivo se cambio por 100 μl de medio fresco por placa conteniendo diferentes concentraciones del extracto a analizar y 1 μ Ci 3H de prolina marcada Después de 24 horas de incubación se extrajo el colágeno de cada placa por la adición de 100 μl de ácido acético 1 M que contenía 1 mg/ml de pepsina y almacenado a 4°C durante la noche Los contenidos de las placas se traspasaron a tubos de polipropileno en los cuales se añadieron 800 μl de ácido acético 0,5M que contenía una sal neutra soluble de colágeno de piel de rata (200 μl) como diluyente Los tubos se centrifugaron a 4000 g durante 20 minutos El colágeno fue precipitado a partir del sobrenadante por la adición de 250 μl de NaCI en ácido acético (25%) pro tubo Después de 2 horas, los tubos se centrifugaron a 4000 g durante 30 minutos los precipitados se redisolvieron en 300μl 0,15 M NaCI en 0.05M de tπs-HCI, pH 7,5 El colágeno se precipitó por la adición de 2 mi de NaCI 4,5 M en el mismo tampón Después de 2 horas, los tubos se centrifugaron a 4000 g durante 30 minutos El sobrenadante se descartó y los precipitados de colágeno se lavaron en 2 mi de etanol al 2% y centrifugado a 4000 g durante 30 minutos Finalmente cada precipitado se disolvió en 250 μl de ácido acético 0,5 M y se llevó a un vial de escinlizacion y se midió en un contador de escinlización líquida con un estándar externo
El porcentaje de incorporación de colágeno para diferentes concentraciones de oleorresina se muestra a continuación, siendo el valor indicado la media de 4 experimentos paralelos
% de incorporación de H3-prolιna en el colágeno
CONTROL 100%
0,1 % Etanol 126%
0,01 μg/ml 120%
0,1 μg/ml 1 15%
0,5 μg/ml 130%
1 μg/ml 170%
5 μg/ml 20%
10 μg/ml 10%
50 μg/ml 20%
Tenascina
Los fibroblastos se cultivaron en microplacas con una densidad de 20 000 células por placa con medio RPMI sin FCS Después de 24 horas a 37°C en una atmósfera al 5% de CO2 el medio de cultivo se cambió Las células se incubaron 48 horas más a 37°C con diferentes concentraciones de oleorresina Las células se lavaron 3 veces con PBS con BSA al 1 % y Tween 20 al 0,1% Las células se fijaron una solución metanol/acetona (1 1 ) y lavados 3 veces como se describe arriba e incubadas con un anticuerpo antitenascina monoclona! durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las células se incubaron con un anticuerpo monoclonal antiratón de cabra con fosfatasa alcalina. Las células fueron lavadas 3 veces e incubadas con fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml) durante 15 minutos. Las microplacas fueron centrifugadas a 200 g y 100 μl del sobrenadante se transfiero a una nueva microplaca. Las placas se leyeron en un lector ELISA a 405 nm.
El porcentaje del contenido tenascina respecto al control para diferentes concentraciones de oleorresina se muestran a continuación, siendo los valores la media de 3 experimentos.
% de tenascina respecto al control.
CONTROL 100%
0,1 % Etanol 1 15%
0,1 μg/ml 90%
0,5 μg/ml 60%
1 μg/ml 50%
5 μg/ml 40%
10 μg/ml 30%
20 μg/ml 20%
Ejemplo 4.- Ilustra los resultados obtenidos con el gel hidrosoluble de oleorresina de Hypericum perforatum L. en el cicatrizante.
Producto A.- Gel hidrosoluble con un contenido de 0,1 % de oleorresina de Hypericum perforatum L.
Producto B.- Gel hidrosoluble con un contenido del 0,5% de oleorresina de Hypericum perforatum L.
Grupo 1.- 12 pacientes con patología dermatológica que requieren la extirpación de las mismas mediante bisturí eléctrico, nitrógeno líquido o láser y no hay requerimiento de sutura, se tratan clínicamente las quemaduras. Grupo 2 - Pacientes con patología dermatológica que requiere la extirpación y cierre quirúrgico mediante sutura se tratan clínicamente las heridas
Resultados grupo 1 Quemaduras quirúrgicas Control 48 horas
Figure imgf000012_0001
Control 7 días
Figure imgf000012_0002
TGN Tejido de granulación normal TGNH- Tejido de granulación hemorrágico Control 15 días - En ambos grupos no se han observado cicatrices hipertróficas ni queloidea
Resultados grupo2 heridas quirúrgicas Control 48 horas
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0004
Control a los 15 días
No se observan cicatrices hipertróficas ni queloidea
Conclusiones
- Efecto cicatrizante - Los productos han sido bien tolerados no apareciendo ni inflamación ni infección
- No hay efectos colaterales
- No ha habido cicatrices hipertróficas
- Fácil seguimiento de las lesiones sin retirar el producto
- No se observo maceración de la piel

Claims

REIVINDICACIONES
1 - Oleorresina de Hypeπcum perforatum L que contiene no menos de un 10% de hiperfoπna y no menos de un 0,5% de hipeπcinas caracterizada porque no contiene conservantes y el contenido en hiperíoπna no disminuye con el tiempo
2 - Procedimiento para la preparación de una oleorresina de Hypeπcum perforatum L estable en su contenido en hiperfoπnas caracterizada porque comprende a) Extracción del Hypeπcum perforatum L con uno o vanos disolventes orgánicos con una polaridad menor a 0 6 b) Evaporación del disolvente c) Disolución del extracto primario obtenido en los pasos anteriores con mezclas alcanol- agua a 40-50°C y posterior filtración d) Evaporación a presión reducida del disolvente
3 - Procedimiento de obtención de una oleorresma según la reivindicación 2 caracterizado porque los alcandés utilizados en la purificación del extracto son metanol, etanol o isopropanol
4 - Procedimiento de obtención de una oleorresina de Hypeπcum perforatum L según los reivindicaciones 2 y 3 caracterizados porque las mezclas de alcanoles son etanol agua (60 40)
5 - Procedimiento de obtención de una oleorresina de Hypeπcum perforatum L según cualquiera de las reivindicaciones 2 3 y 4 caracterizada porque la planta es secada a menos de 35°C
6 - Procedimiento de obtención de una oleorresina de Hypeπcum perforatum L según cualquier de las reivindicaciones 2, 3 4, 5 y 6 caracterizada porque el contenido en hiperfoπnas de la planta es superior al 2% 7 - Utilización de una oleorresina de Hypeπcum perforatum según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para preparación de un medicamento para regular la producción de los componentes de la matriz extracelular en fibroblastos humanos
8 - Utilización de una oleorresina de Hypeπcum según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para regular la producción de colágeno.
9 - Utilización de una oleorresina de Hypeπcum según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para regular la producción de tenascina
10 - Gel hidrosoluble utilizable como cicatrizante caracterizado porque contiene como principio activo una oleorresina de Hypeπcum perforatum L y agentes diluyentes, formadores de geles, emulsificantes y conservantes
11 - Gel hidrosoluble según la reivindicación 10 caracterizado porque el diluyente es agua
12 - Gel hidrosoluble según la reivindicación 1 1 caracterizado porque el agente gelificante es po acπlato de gliceπlo
13 - Gel hidrosoluble según la reivindicación 11 caracterizado porque el agente humectante es gliceπna
14 - Gel hidrosoluble según la reivindicación 11 caracterizado porque los agentes emulsificantes son PEG-40-hydrogenated castor oil, polιsorbato-20 y/o octoxιnol-11
15 - Gel hidrosoluble según la reivindicación 11 caracterizado porque los agentes conservantes son parabenos
16 - Procedimiento de obtención de un gel hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 caracterizado porque comprende a) Disolución de la oleorresina de Hypeπcum perforatum L. en los emulsificantes b) Disolución de los conservantes en agua c) Incorporación de la mezcla de la oleorresina de Hypeπcum y los emulsificantes en la disolución de los conservantes d) Incorporación a la mezcla anterior el humectante y agente gelificante con agitación
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